您是否在过去两个月内重复过PCR电泳?

您是否在过去两个月内重复过PCR电泳?
过去2个月重复的PCR电泳总是只有引物二聚体没有目标条带,我的PCR条件是1μl模板(100 ng浓度)的上游和下游1μl引物(10μM/ L浓度)有。pcrmix10ul(使用Biotek混合物,也使用Takara EXTaqHS)自由水7ul 94°C 5分钟94°C 30s 55-60°C 30s 72°C 1分钟72°C 10分钟从173到690非常清楚内部参考所以我认为这不是我的cdna模板问题,起初我认为这是一个引子问题,我还检查了很多英文文献,Oligo 7软件检查了所有引物这是。我选择了最合适的引物对。我现在很困惑。我想请一位专家帮我分析一下我在网上检查答案的原因,但我不明白一些问题。
我有1μL的高值,因为我读过一些文章中引物的工作浓度是20μM/ L,虽然引物浓度问题,引物浓度太大而且不能产生二聚体它似乎不是。20μl系统和内部参考也是一个优势。数量,内部参考用尽2。
退火温度的问题,与退火温度梯度相同,无带,只有二聚体3。
模板浓度问题,我的模板浓度是100 ng,我不知道是否合适。
有很多关于Mg 2+浓度的文章,Mg 2+浓度对实验有很大影响,但我不知道如何调整它。我应该在购买的PCR产品中加入Mg 2+吗?
什么减少混合物的量?
如果是这样,酶的量不会太低。
引物设计存在问题,我发现Primer 5和Oligo 7验证的结果非常不同。由引物5设计的引物在OLigo中不是很好。由Oligo设计的引物被Primer 5严格验证,我不敢自己设计,使用Oligo验证,我使用了几对我们选择了一种显示二聚体形成的引物,然而,由于GG相对较低,PCR选项的结果没有线索,表明这应该是可以接受的。
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Oligo验证的文件中有许多引物。我没有使用它们,因为它们都表明上游和下游引物之间的熔化温度差异很大。他们让我心烦意乱。文献中的许多引物都是未经验证的,所以你可以为其他引物做这些引物。
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最后,添加试剂的顺序存在问题。我想首先加水,然后加入混合物,然后加入底漆,最后加入模板。它不是很好,我应该添加最后一个混音?
对于这么多问题,到目前为止,我希望如果有人能帮助我,我就无法做到。折叠,你必须添加一个问题,8
酶效率问题对我的酶不好吗?
变性前5分钟不要缩短。如果将循环变性时间添加到45秒,是否有任何改善?
RT-PCR产物的电泳仅产生引物二聚体,不存在目标条带,引物交换也是如此,请老师回答原因!
高分
1
楼上说这很有道理。
不同的Taqs具有非常不同的效果。
在我使用的几十种酶中,QIAgen的HOTSTARTMASTERMIXPLUS通常可以得到一种产品,所以我推荐它(你推荐它,通常它是免费的)。
此外,您的目标基因表达水平低吗?
PCR的目的是什么?
建议首先找到一个代表丰度的系统,并验证您的引物是否有效。
由于表达水平非常低,PCR轮次很可能不会产生产物。建议使用NESTED PCR,其中包括设计两组嵌套引物。第一轮首先使用外部对,理论上你可以得到一个。(从运行的粘合剂中看不到它)然后将PCR产物稀释50倍,然后使用内部引物对。充气后,您可以在驾驶时获得通常看起来像橡胶的产品数量。
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对于Primer Design,建议使用Primer3plus。Primer3plus是一款免费的在线设计软件。
超过您使用的参考数量。
你可以在谷歌上做到这一点。